Kultur zerebraler Organoide und Assembloide im CERO 3D Bioreaktor
Etablierung muriner aNSC-Protokolle im CERO Bioreactor
In diesem Projekt wird der CERO 3D Bioreactor erstmals eingesetzt, um murine adulte neurale Stammzellen (aNSCs) zu kultivieren, zerebrale Organoide und Assembloide aus Hirntumoren zu entwickeln. CERO 3D ist mit humanen Stammzellen bereits erprobt; wir haben seine Leistung mit murinen aNSCs untersucht und mit herkömmlichen Verfahren in der Wellplatte verglichen. Ausgewertet wurden Skalierbarkeit, Wachstumsdynamik und Langzeitstabilität der Kultur.
Wichtigste Ergebnisse
Skalierbarkeit
Größere Zellkulturen mit weniger Handarbeit und höherer Gleichmäßigkeit.
Wachstumsdynamik
Kontrollierteres Wachstum, seltenere Passagen und weniger Handarbeit.
Langzeitkultur
Organoide wachsen über lange Zeiträume weiter, in gleichbleibender Form und mit minimalem Eingriff.
Die folgenden Punkte zeigen, wie überlegen der CERO Bioreactor murine aNSCs und zerebrale Organoide kultiviert. Sie belegen seine Vorteile bei Skalierbarkeit, Effizienz und Langzeitkultur gegenüber herkömmlichen Kulturverfahren.
20x höhere aNSC-Kulturkapazität
Bis zu 50 Millionen Zellen je CEROtube – gegenüber herkömmlichen Verfahren in der Wellplatte.
5 Tage
...bis zur ersten Neurosphärenbildung, mit langsamem, kontrolliertem Wachstum und kaum Verklumpung.
2–4x seltenere aNSC-Passagen
Die ständige Bewegung verzögert die frühe Neurosphärenbildung und macht häufiges Passagieren entbehrlich.
50 % weniger Handarbeit
Weniger Medienwechsel und weniger Zeit an der Bank als bei Kulturen in der Wellplatte.
> 200 zerebrale Organoide
...je CEROtube – Organoidproduktion im großen Maßstab.
> 5 Monate
...stabile Organoidkultur mit gleichbleibender Form und Größe.
Im Vergleich: CERO 3D und Orbitalschüttler/6-Well-Suspensionsplatte
Morphologie - CERO 3D
Zerebrales Organoid nach fünf Monaten Kultur
Gekennzeichnet durch gleichmäßige Größenverteilung, runde Formen und proliferierende Kernbereiche.
Morphologie - Orbitalschüttler
Zerebrales Organoid nach drei Monaten Kultur
Gekennzeichnet durch ungleichmäßige Größenverteilung, ovale Formen und apoptotische Kernbereiche.
Skalierbarkeit - CERO 3D
- Hohe Kapazität: Über 200 Organoide je CEROtube, das steigert den Durchsatz erheblich.
- Keine Fusion: Die ständige Bewegung verhindert, dass Organoide verschmelzen; das Wachstum bleibt kontrolliert.
- Effizienter: Das größere Medienvolumen macht häufige Medienwechsel überflüssig und spart Material und Zeit.
Skalierbarkeit - Orbitalschüttler
- Begrenzte Kapazität: Etwa 10–30 Organoide je Well; wachsen sie heran, berühren sie den Boden, was das Wachstum beeinträchtigt.
- Schwankende Größe: Organoide über 800 µm werden durch Platzmangel und ungleichmäßige Durchmischung oft unterschiedlich groß und nehmen eine Donut-Form an.
Wachstumsdynamik - CERO 3D
- Kontrolliertes Wachstum: Die langsamere Anfangsbildung ergibt gleichmäßige, runde Organoide und verhindert frühes Verschmelzen.
- Dauerhafte Suspension: Die Organoide bleiben in Suspension, berühren den Boden nicht und wachsen gleichmäßig bei gleichem Zugang zu Nährstoffen.
Wachstumsdynamik - Orbitalschüttler
- Ungleichmäßiges Wachstum: Ab etwa 800 µm werden die Organoide unterschiedlich groß, flachen ab oder nehmen eine Donut-Form an.
- Bodenkontakt: Die Organoide setzen sich am Wellboden ab, das stört das gleichmäßige Wachstum.
Langzeitkultur - CERO 3D
- Über 5 Monate stabil: Die Organoide bleiben vital, mit proliferierendem Kernbereich und runder Form – lange Kulturdauer ohne Neuansatz.
Langzeitkultur - Orbitalschüttler
- Vitalität sinkt nach 3 Monaten: Größere Organoide entwickeln apoptotische Kernbereiche und müssen ersetzt werden.
Neue Wege in der
Assembloid-Kultur
Zerebrale Assembloide: ein 3D-Kokulturmodell
Zerebrale Assembloide, eine Kokultur aus verschmolzenen zerebralen Organoiden und Tumorsphäroiden, sind ein aufkommendes 3D-Modell im Sinne der 3R und eine Alternative zu in vivo durchgeführten Studien. Ihr entscheidender Vorteil liegt darin, dass sie gesundes und krankhaftes Gewebe zugleich abbilden und damit den Verhältnissen bei Krebspatienten sehr nahekommen. Trotz dieses Potenzials haben Assembloide Grenzen: Zerebrale Organoide und Sphäroide sind kugelige Gebilde, die man zusammenlegt; ihre Berührungsflächen bleiben begrenzt, typischerweise sind weniger als 10 % ihrer Oberfläche miteinander verbunden. Das bildet die klinische Situation nicht ab, in der ein Hirntumor häufig vollständig von gesundem Hirngewebe umgeben ist und dadurch komplexere Wechselwirkungen im Tumormikromilieu (TME) entstehen.
In unserer Machbarkeitsstudie zeigen wir, dass der CERO Bioreactor diese Grenze überwindet. Er erzeugt Assembloidmodelle mit über 50 % verbundener Oberfläche, ein deutlicher Fortschritt, der die Wechselwirkungen zwischen Tumor und Gewebe im klinischen Alltag besser abbildet.
Gliom-Assembloid - CERO 3D
Gliom-Assembloid - Orbitalschüttler
Kurzbeschreibung des Versuchs
Zuvor differenzierte zerebrale Organoide wurden mit GL261-Gliomsphäroiden kokultiviert (10.000 Zellen je Well in einer 96-Well-ULA-Platte ausgesät und 3 Tage vorinkubiert). Organoide und Sphäroide wurden gemeinsam in eine neue 96-Well-ULA-Platte gesetzt, sodass sich über 72 Stunden enge Zell-Zell-Verbindungen bilden konnten. Nach 72 Stunden wurde die Hälfte der Assembloide in ein CEROtube überführt, die andere Hälfte blieb in der 96-Well-ULA-Platte. Nach weiteren 48 Stunden (insgesamt 120 Stunden) wurden die Assembloide fixiert, geschnitten und für die Auswertung mit H&E, Ki-67 und Caspase-3 gefärbt.
Im Vergleich: CERO 3D und besonders anhaftungsarme 96-Well-Platten
Ki-67 Proliferationsmarker - CERO 3D
Ki-67 Proliferationsmarker - ULA-Platte
Caspase-3-Apoptosemarker - CERO 3D
Caspase-3-Apoptosemarker - ULA-Platte
Skalierbarkeit - CERO 3D
- Höhere Komplexität: Die größte Stärke liegt im höheren Differenzierungsgrad des Modells.
- Mehrere Assembloide: In einem einzigen CEROtube lassen sich mehrere Assembloide kultivieren.
Skalierbarkeit - ULA-Platte
- Kleiner Maßstab: Einzelne Assembloide lassen sich bilden, die Zahl der Wells begrenzt jedoch den Umfang.
Wachstumsdynamik - CERO 3D
- Bessere Fusion: Fördert eine Verbindung von über 50 % der Oberfläche zwischen Organoiden und Tumorsphäroiden.
- Nähe zum In-vivo-Bild: Bildet die Tumorinvasion naturgetreu ab: In der H&E-Färbung wachsen die zerebralen Organoide um mehr als die Hälfte des Tumorgewebes herum.
- Stärkere Proliferation: Die Ki-67-Färbung zeigt Proliferation sowohl im Gliom- als auch im Organoidgewebe.
- Höhere Vitalität: Die Caspase-3-Färbung zeigt weniger Apoptose; die Zellen sind vitaler als in der ULA-Platte.
Wachstumsdynamik - ULA-Platte
- Begrenzte Wechselwirkung: Weniger als 10 % der Oberfläche verbinden Organoide und Gliomsphäroide; die Wechselwirkung zwischen Tumor und Organoid bleibt schwächer.
- Geringere Proliferation: Die Ki-67-Färbung zeigt im Organoidteil des Assembloids über längere Kulturdauer eine verminderte Proliferation.
- Vermehrte Apoptose: Die Caspase-3-Färbung zeigt im Organoidgewebe mehr Apoptose als im CERO-Modell.
Langzeitkultur - CERO 3D
- Bessere Fusion: Die stärkere Wechselwirkung zwischen Organoid und Tumor ermöglicht eine bessere Langzeitkultur.
- Weniger Apoptose: Die geringere Apoptose und proliferierende Kernbereiche in Gliom- und Organoidgewebe ergeben ein stabileres, langlebigeres Modell.
Langzeitkultur - ULA-Platte
- Begrenzte Wechselwirkung: Die Fusion von Organoid und Tumor bleibt schwach, das mindert die Belastbarkeit von Langzeitstudien.
- Mehr Apoptose: Erhöhte Apoptoseraten, wie die Caspase-3-Färbung zeigt, mindern die Eignung des Modells für längere Untersuchungen.
Ein besonderer Dank
We are truly grateful to Dr. Andreas Friese and Dr. Markus Uhrig at OLS OMNI Life Science for giving us the opportunity to work with the CERO. Your support and specialist training have been invaluable and it has been a pleasure collaborating with both of you. We look forward to continuing our joint work, now focusing on brain slice cultivation.
Anna Wolfram, Vanessa Arnold & Prof. Dr. Lisa Sevenich